水果中相當部分的干物質是有機酸,它往往比許多其他物質更多地決定水果的特殊味道,并在食品營養學中占有重要位置，有機酸除了具有抗生素作用外，還具有其它幾種作用，包括降低消化物pH和增加胰腺分泌。不同種類的水果中有機酸的種類和含量差別很大,故在現代食品工業中對有機酸的研究已愈加重視和普及。液相色譜法操作簡便、準確度高、重現性好,可同時定量測定多種有機酸,但液相色譜法測定水果中有機酸的報道中有機酸種類及水果品種相差較多，尤其是草莓與油桃這兩類水果未見報道。
考慮到***體成分復雜,從保護色譜柱及提高分離效果的目的出發,本文將卡瑞(Carrez)試劑作為水果樣品凈化劑應用于水果中有機酸的測定.
1實驗部分
1.1儀器與試劑
Agilent1100液相色譜儀(含四元泵、柱溫箱、可變波長紫外檢測器、手動進樣器、定量環等).水相針式過濾頭,去離子水(電阻率可達18MΩ·cm).草酸、酒石酸、維生素C(抗壞血酸)、L2蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸(丁二酸)等有機酸對照品均為分析純試劑.甲醇為色譜純試劑,磷酸二氫鈉及磷酸為分析純試劑.流動相經0.45μm濾膜過濾.樣品為市售新鮮水晶梨、碭山梨、蘋果梨、新疆香梨、新疆貢梨、富士蘋果、草莓、油桃等
1.2對照品及供試品溶液的制備
對照品溶液的制備:分別稱取適量各有機酸對照品(0.5～1.5g,至0.1mg),分別用流動相緩沖溶液溶解并定容于100mL容量瓶中,作為有機酸的標準貯備液.使用時各取1.00mL配制成有機酸的混合標準液,再將混合標準液在25mL容量瓶中用流動相緩沖溶液稀釋成不同的濃度梯度,即上述溶液濃度的0.2,0.4,0.6,0.8,1.0倍。
供試品溶液的制備:榨汁法制樣(選果2削皮2切片2榨汁2過濾),所得果汁準確稱取3g左右,加入適量流動相緩沖溶液后,加入Carrez試劑I和II各0.1mL,再用流動相緩沖溶液定容于25mL容量瓶中,靜置
1.3色譜條件
色譜柱:EclipseXDB2C8柱(4.6×150mm,5μm);流動相A:甲醇,流動相B:0.01mol·L-1磷酸二氫鈉2磷酸緩沖液(pH=2.6);梯度洗脫程序:0～2.4min內,由7.5%A變化為1.5%A,此后流動相A的比例不變.流動相流速:0.5mL·min-1;進樣體積:20μL;紫外檢測波長:214nm;柱溫:25°
2結果與討論
2.1色譜條件的優化
2.1.1檢測波長的確定
對每種有機酸的吸光度進行波長掃描,發現這8種有機酸的zui大吸收波長在204～243nm之間.并經實驗確定214nm為檢測波長。
2.1.2流動相的選擇及其pH值的確定
甲醇2水系統或甲醇2磷酸鹽緩沖系統是在C8或C18柱中應用zui廣的流動相,經實驗發現用甲醇2磷酸鹽緩沖系統更適合使用C8柱分析有機酸.由于流動相的pH值對有機酸的保留時間有較大影響,因此,通過調節流動相的pH值(pH2.3,2.5,2.6,2.7,2.8)對8種有機酸進行檢測,當pH值較小時草酸與酒石酸分離效果很好,但富馬酸和琥珀酸分離效果不佳;當pH值較大時結果相反.pH值為2.6時分離效果較好.
2.1.3流動相流速
實驗分別考察了0.2,0.5,0.8,1.0mL·min-14個條件.流速為0.5mL·min-1時,色譜分離效果.
2.1.4流動相的配比
分別考察了等度洗脫(甲醇含量分別為1%,2%,3%,5%,6%)及梯度洗脫兩種情況.發現在等度洗脫中,當甲醇比例較大時草酸與酒石酸分離較好,但檸檬酸與乳酸、富馬酸和琥珀酸分離效果不佳;當甲醇比例較小時分離情況相反.且每種甲醇比例均不能使維生素C與L2蘋果酸得到有效分離,說明等度洗脫不能滿足分離要求.根據上述經驗,經多次實驗嘗試了各種梯度后,發現當梯度為0～2.4min內,流動相中甲醇的比例由7.5%變化為1.5%,此后流動相A的比例不變時,維生素C與L2蘋果酸分離較好并能夠進行定量分析,其他有機酸也能達到分離的目的。
2.2線性關系、檢出限、精密度及回收率
將混合標準有機酸的系列工作溶液,按上述色譜條件依次由低濃度向高濃度經0.45μm針頭過濾后進樣20μL,采集數據.分別以各組分的峰面積y對標準工作溶液的濃度x(mg·mL-1)進行線性回歸分析,8種有機酸的回歸方程、相關系數及檢出限見表1。
準確稱取相同樣品(水晶梨)兩份,其中1份加入已知量有機酸標樣,另一份不加,每份樣品平行測定3次,利用增量法計算回收率,并計算變異系數。
由表1可知,有機酸回歸方程的相關系數大于0.9995,線性良好.本法的回收率在93.01%～101.79%之間,變異系數在4%以內,精密度較高,結果準確。
2.3樣品制備方法的探討
2.3.1關于榨汁制樣法與水果中維生素C含量的測定
采用榨汁法測定水果中有機酸,未能檢測出水果中的維生C,故懷疑在樣品制備過程中,維生素C被破壞而未能檢測到.本實驗也采用榨汁法制樣并檢測到了維生素C,且效果良好.比較本實驗，發現制樣過程中有明顯不同的一點就是本實驗采用流動相酸性緩沖液定容,選用純水定容.這是由于液體維生素C具有較強的還原性,易受空氣、熱、光等因素影響,但在酸性溶液中較穩定.故采用榨汁法制樣,用流動相酸性緩沖液定容,從而實現了維生素C的檢測。
2.3.2樣品制備中加入Carrez試劑
液相色譜法對樣品的處理要求較高,一方面要求樣品成分盡量簡單以消除基體對測定對象的干擾,另一方面對色譜柱的容量、使用壽命等保護色譜柱的角度要求進柱之前的樣品盡量簡單.而水果原汁樣品往往成分復雜,基體干擾大,對色譜柱負擔重.本實驗從保護色譜柱及提高分離效果的目的出發,嘗試向水果樣品中加入Carrez試劑,使蛋白質、脂肪等雜質沉淀。
在含果汁3g左右,欲25mL定容的樣品中加Carrez試劑I和II各0.1mL與不加Carrez試劑的原樣進行檢測對比,實驗結果表明,加入Carrez試劑I和II各0.1mL,色譜峰數及保留時間基本不變,其有機酸含量也基本保持不變,即Carrez試劑的加入不影響水果有機酸含量的測定.如果增加Carrez試劑的加入量(如加入0.25mL),則對樣品中有機酸的測量產生一定影響,使測量值普遍偏低(富馬酸除外)。
加入Carrez試劑的另一特點就是可以提高有機酸分析的精密度和回收率,實驗結果見表2.加入Car2rez試劑處理樣品后每種有機酸的測定精密度均有不同程度的提高,乳酸、檸檬酸、富馬酸的回收率也比不加Carrez試劑時有了明顯好轉。
2.4不同水果有機酸含量的分析結果
2.4.1不同梨品種中有機酸含量
按2.1和2.3中所述的*色譜檢測條件和制樣方法,分別測定水晶梨、碭山梨、蘋果梨、新疆香梨、新疆貢梨中的有機酸.不同品種梨中有機酸含量見表3。
由表3可知,不同品種梨中各種有機酸所占的比例基本相同.碭山梨草酸含量低(0.228),維生素C含量較高(0.546).水晶梨雖然草酸含量略高(0.307),但維生素C(0.450)、蘋果酸(1.651)、檸檬酸(1.027)含量較高.蘋果梨中蘋果酸(1.807)與檸檬酸(1.107)含量高,但相應的維生素C含量較低(0.323),且草酸含量略高(0.391)。
2.4.2不同水果中有機酸含量
按2.1和2.3中所述的*檢測條件和制樣方法,分別測定草莓、水晶梨、富士蘋果、油桃水果中有機酸含量見表4。
由表4可知,草莓(0.592)和梨(0.450)中維生素C含量較高,蘋果(2.482)和油桃(3.400)中蘋果酸含量較高.油桃中有機酸種類zui為豐富,營養全面,且草酸含量低(0.242).梨中維生素C含量高(0.450),草酸含量低(0.307),相對營養價值zui高.草莓維生素C(0.592)及檸檬酸(7.505)含量*,但草酸含量也zui高(1.137),可作為提取維生素C及檸檬酸的原料。
實驗建立了一種液相色譜測定水果中有機酸類物質的方法.使用C8柱,甲醇2磷酸鹽緩沖溶液為流動相,梯度洗脫,在6min內較好地分離和定量分析了草莓、梨、蘋果及油桃等水果中8種有機酸的含量.使用Carrez試劑作為水果樣品凈化劑,不僅可達到凈化樣品、保護色譜柱的目的,同時可以適當提高樣品檢測的精密度和回收率.該方法不僅準確、可靠、重復性好,而且分析效率高.為定量分析能夠榨成汁的水果中有機酸類物質的含量提供了參考,對水果食品加工及保鮮有一定的實際意義.用該方法分析了不同品種梨中各有機酸的含量,結果顯示不同品種梨中各種有機酸所占的比例基本相同.幾種水果中油桃含有機酸種類zui為豐富,草莓中維生素C及檸檬酸含量*。
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